Construcción de un vector con el gen crv1 para modificación genética de plantas

Abstract

"Los polidnavirus son virus asociados a avispas parasitoides, los cuales permiten la supervivencia de la avispa dentro de su hospedador mediante la expresión de ciertos genes, algunos de los cuales se ha detectado que cuentan con actividad inmunosupresora. Por ello, los genes de polidnavirus han despertado el interés de los investigadores como una alternativa más amigable a los plaguicidas empleados en el sector agrícola. En el presente trabajo se construyó mediante el método tradicional con enzimas de restricción un vector para la transformación de plantas el cual, posee el gen inmunosupresor CrV1 del polidnavirus de Cotesia rubecula. El fragmento CrV1 se amplifico mediante PCR empleando cebadores específicos los cuales contenían adaptadores para las enzimas de restricción NcoI y BstEII, luego se purificó y se procedió a digerirlo con dichas enzimas. A la par, el vector pCAMBIA1301 se multiplicó en la cepa de E.coli DH5? y se purifico para de igual manera ser digerido con las enzimas ya mencionadas. Se realizó la ligación del fragmento CrV1 y el vector pCAMBIA1301 digeridos y purificados empleando la enzima T4 ligasa, se realizó la transformación con los productos de ligación y se sembraron en placas de selección con kanamicina. Se obtuvieron 31 clonas de las cuales se analizaron 22 mediante PCR en colonia para determinar la presencia del fragmento, obteniendo como resultado 13 colonias positivas. Una vez detectada la presencia del fragmento se seleccionaron las clonas uno y dos para extraer las construcciones. Las construcciones se mandaron a secuenciar para tener mayor certeza tanto de la presencia como de la direccionalidad del fragmento CrV1. Los resultados de la secuenciación demostraron que en efecto la secuencia CrV1 se insertó en el sitió esperado bajo el promotor CaMV 35 y aguas arriba del terminador NOS"