Efecto de factores abióticos en la expresiónde genes de la biosíntesis de aflatoxinas y ocratoxinas en hongos aislados de café

Abstract

"México es el octavo productor mundial de café; el gasto en hogares en café y derivados es de unos 4000 millones de pesos anualmente. El 90% de la producción está concentrada en Chiapas (38.8%), Veracruz (22.6%), Puebla (17.3%) y Oaxaca (11.4%). Entre los años 2008/9las exportaciones subieron un 8.6% y las mismas van dirigidas principalmente a USA, Bélgica, Alemania, Japón y Canadá. Los sustratos alimenticios, se encuentran expuestos al ataque de hongos, entre ellos los que producen micotoxinas. Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por ciertas especies de hongos, que tienen efectos negativos en la salud del hombre y los animales. Son neuro y nefro tóxicas, oncogénicas y teratogénicas, además, producen daño pulmonar y hepático. Las principales micotoxinas presentes en el cultivo del café son la ocratoxina A(OTA), las aflatoxinas, (AF) y la patulina (PAT). Existen factores que condicionan la producción de micotoxinas, siendo los principales la temperatura y la actividad del agua, tanto para el desarrollo del hongo como para la producción de la toxina, el pH condiciona la respuesta del hongo a estos factores. La síntesis de las AF ha sido bien estudiada y se conocen los genes implicados en su biosíntesis siendo, los más importantes nor-1; ver-1;omt-A y aflR. Para las OTA: PKSs. La vía de síntesis de OTA en los Aspergilluses prácticamente desconocida. En cuanto a los factores que afectan la expresión de esos genes, muy poco se ha estudiado aún. Es por estas razones que se planteó verificar el efecto de los factores abióticos sobre la expresión de genes de la biosíntesis de OTA y AF en hongos del género Aspergillus de las Secciones Flavi y Nigri aislados de café. Se tomaron 25 muestras compuestas de 250 gramos cada una de la cosecha del día de café cereza de dos localidades en el estado de Veracruz, en Teocelo e Ixhuatlán del Café; el primero con manejo convencional, el segundo con manejo orgánico, ambos de la variedad Oro Azteca. Se realizó el proceso de beneficiado húmedo de las mismas y se obtuvieron xiv micobiotas en las etapas de café cereza, posterior al proceso de fermentación, a los 6 días del proceso de secado, a finalizar el proceso de secado, en café pergamino, oro y tostado; paralelamente se realizaron micobiotas en tres marcas de cafés comerciales reconocidas. Para la identificación se realizó la observación de características morfológicas macro y microscópicas en medios diferenciales. Se calculó la incidencia por medio de la frecuencia absoluta y la densidad relativa de los hongos presentes. Se detectaron hongos de los géneros Acremonium sp., Alternaria sp., Aspergillus sp., Cladosporium sp., Colletotrichum sp., Fusarium spp., Geotrichum sp., Penicillium sp., Rhizoctonia sp., Rhizopus sp.y Stemphillium sp.. En el café manejado orgánicamente se detectó una mayor incidencia de hongos del género Aspergillusa lo largo del proceso del beneficio. Los hongos pertenecientes al género Aspergillusfueron purificados; por medio de diluciones se realizaron cultivos monospóricos y se procedió a la identificación de los mismos por medio de claves taxonómicas mediante el uso de medios diferenciales a temperaturas pre establecidas. Se pre seleccionaron dos cepas, una de Aspergillus Sección Flavi, cepa 51, de café oro y la cepa 23 de Aspergillus Sección Nigri, de café pergamino; se tomó también como testigo una cepa de Aspergillus flavus, de referencia proveída por la Unidad de Investigación en Granos y Semillas, UNIGRAS de la Universidad Nacional Autónoma de México, UNAM. Se realizó la reconfirmación de la identidad de las cepas pre seleccionadas y posteriormente se caracterizaron molecularmente las rutas de biosíntesis de AF y OTA presentes en las mismas. En la cepa 51 se detectó la presencia de los genes estructurales nor-1, ver-1, omt-A y el activador de la transcripción aflR, de la vía de síntesis de las AF. En la cepa 23, se detectó la presencia de los genes Acarp450 y AckS9 de la vía de síntesis de las OTA, por lo cual se consideró que las cepas pre seleccionas son potencialmente productoras de xv toxinas. A continuación, se determinaron el efecto del pH y de la actividad del agua sobre la expresión de los genes aflR de la biosíntesis de las AF y Acarp450 de la biosíntesis de las OTA. Los rangos de pH considerados en el experimento variaron de 4.5 a 13.5 para la cepa 51 y de Referencia UNAM y de 4.5 a 11.5 en la cepa 23. A las 72 horas de crecimiento se activó la vía de síntesis de las AF en los testigos, tanto de la cepa Referencia como la 51 de café, a pH 7 y aw 99 y bajo la condición pH 4.5 y aw 0.99 en la cepa 51. A partir de las 48 horas de crecimiento se activó la vía de síntesis de las OTA en la cepa de A. Sección Nigri pre seleccionada bajo todas las condiciones propuestas en el experimento."

"Mexico is the eighth largest producer of coffee, household spending on coffee and derivatives is about 4000 million dollars annually. 90% of production is concentrated in Chiapas (38.8%), Veracruz (22.6%), Puebla (17.3%) and Oaxaca (11.4%). Between 2008/9 exports increased in 8.6% and the same are intended mainly to USA, Belgium, Germany, Japan and Canada. Foodsubstratesare exposedto attack byfungi, including those that producetoxins. Mycotoxins are secondary metabolites produced by certain species of fungi, which have negative effects on human health and animals. Are neuro and nephro toxic, oncogenic, teratogenic, cause lung damage and liver. The main mycotoxins in coffee cultivation are the ochratoxin A (OTA), the aflatoxins (AF) and patuline (PAT). Factors that influence the production of mycotoxins, are temperature and water activity for both fungal growth and for the production of the toxin, the pH affects the response of the fungus to these factors. The synthesis of aflatoxins has been well studied and known genes involved in its biosynthesis being the most important nor-1, ver-1, omt-A and aflR; for Ochratoxins: PKSs. The synthesis of OTA inAspergillus is virtually unknown. As for the factors affecting the expression of these genes, very little has been studied yet. It is for these reasons that arose check the effect of abiotic factors on the expression of genes for the production of OTA and AF fungi Aspergillus Section Flavi and Nigri isolated from coffee, for which, 25 composite samples were taken 250 grams each one, of the day's harvest of coffee cherries of two points in the state of Veracruz, Ixhuatlán Teocelo and Coffee, the first with conventional management, the second organic management, both of Aztec Gold. We performed the wet milling process and conducted them in stages micobiotas coffee cherry, after fermentation, after 6 days of the drying process, to terminate the process of drying, parchment, gold and toastedmicobiotas were performed in parallel in three coffee xii trademarks recognized. To identify the observation was made morphologic features macro and microscopic differential media. The incidence was calculated by means of the absolute frequency and relative density of the fungi present. Fungi were detected in the genera Acremonium sp., Alternaria sp., Aspergillus sp., Cladosporium sp., Colletotrichum sp., Fusarium spp., Geotrichum sp., Penicillium sp., Rhizoctonia sp., Rhizopus sp. and Stemphillium sp.. In organically managed coffee had a higher incidence of Aspergillus fungi during the process of profit. Fungi belonging to the genus Aspergilluswere purified; by half of dilutions were performed monosporic cultures and we proceeded to the identification of them through taxonomic keys by using differential media at temperatures pre established. Two strains were pre selected, a Section FlaviAspergillus strain 51, of green coffee and the strain of Aspergillus Section Nigri 23, of parchment, also as a witness took a strain of Aspergillus flavus, reference provided by the Unidad de Investigación en Granos y Semillas, UNIGRAS National Autonomous University of Mexico, UNAM. Was performed the reconfirmation of the identity of the strains pre selected and subsequently were molecularly characterized biosynthetic routes AF and OTA present in the same. In strain 51 was detected the presence of the structural genes nor-1, ver-1, omt-A and activator of transcription aflR, the route of synthesis of the AF. In strain 23, was detected the presence of genes Acarp450 and AckS9 of route of synthesis of the OTA, for which it was considered that pre select strains are potentially producing toxins. Were determinedthe effect of pH and water activity on the expression of genes aflR of the biosynthesis of AF and Acarp450 of the biosynthesis of the OTA. pH ranges considered in the experiment ranged from 4.5 to 13.5 for strain 51 and Reference UNAM and 4.5 to 11.5 in strain 23. At 72 hours of growth was activated synthesis pathway FAs in the witnesses, both of the strain xiii reference as the 51 of coffee, at pH 7 and aw 99; and under the condition pH 4.5 and aw 0.99 in the strain 51. From 48 hours of growth was activated route of synthesis of OTA in strain of A. Section Nigri pre selected under all conditions proposed in the experiment."