Identificación de 6 aislados clínicos de cepas de hongos mucorales, y diseño y evaluación de cebadores específicos para Rhizopus oryzae y Cunninghamella bertholletiae, dos especies de alta frecuencia de infección

Abstract

"En resumen, los resultados que obtuvimos en este trabajo de investigación científica fue la identificación del género y especie de 6 cepas de hongos que pertenecen al orden de loa Mucorales mediante la secuenciación y comparación de la subunidad larga del gen ribosomal 28S y el ITS1. Estas especies son Rhizopus oryzae, Cunninghamella bertholletiae, Lichtheimia ramosa y Mucor plumbeus (Tabla 2). Además identificamos regiones disímiles de dos especies de hongos Mucorales de alta frecuencia de infección Rhizopus oryzae y Cunninghamella bertholletiae comparando la secuencia de sus genomas con 998 secuencias de genomas de especies que pertenecen a diversos órdenes incluyendo el de los Mucorales que se sabe interaccionan con el ser humano o pueden estar formando un nicho (Tabla 3). Con estas regiones disímiles diseñamos cebadores de PCR para R. oryzae y C. bertholletiae con la tubería de comandos 'not alike' (Roblero, 2021) y mostramos que esos cebadores son específicos para la especie de hongo para la cual los diseñamos (Tabla 4; Figura 7 - 9). El resultado general de este trabajo, que se puede aplicar en el desarrollo tecnológico, fue el diseño de cebadores específicos para las especies de alta frecuencia de infección que pueden ser implementados en un protocolo de rutina para la identificación rápida y confiable de dichos hongos patógenos R. oryzae y C. bertholletiae en hospitales mediante una técnica relativamente barata como la reacción en cadena de la polimerasa tipo 'multiplex' (PCR). Aunque se han diseñado cebadores específicos de especie para algunas especies de importancia médica, algunos de estos no pueden discernir entre otras especies que pertenecen al mismo género. Voigt y col. (1999) diseñaron cebadores específicos de especie usando como molde regiones polimórficas de ITS1, ITS2 y 28S, sin embargo algunos de los diseños, como el par de cebadores específico para Basidiobolus haptosporus no puede diferenciarlo de B. ranarum. El par de cebadores específico para Cunninghamella bertholletiae no puede diferenciarlo de las especies Cunninghamella elegans y C. polymorpha. El par diseñado para Mucor circinelloides no puede diferenciarlo de M. ramosissimus. El par diseñado para Rhizopus azygosporus no lo puede diferenciar de R. microsporus. Y el par diseñado para Rhizomucor miehei no puede diferenciarlo de R. pusillus. Como hemos visto a en el transcurso de este trabajo hemos mostrado que 'not alike' es una tubería de comandos que automatiza la comparación masiva de secuencia de genomas e identifica aquellas regiones disímiles que son un buen blanco para poder diferenciarlas de otras especies cercanas. Como hemos visto en el trabajo de (Voigt y col, 1999) ellos han diseñado cebadores especie-específicos para algunas especies de Mucorales de importancia médica, pero algunos diseños de cebadores no son realmente tan específicos. Esto se debe a que las secuencias de las regiones ITS1, ITS2 y 28S no son lo suficientemente diferentes para que se puedan diseñar cebadores específicos, por lo tanto hay que buscar otras soluciones. Una solución posible es la exploración sistemática a nivel genómico de regiones disímiles para el diseño de cebadores especie-específicos como la exploración que produce la tubería de comandos 'not alike'. Con estos resultados que obtuvimos, pensamos que 'not alike' daría buenos resultados en el diseño de cebadores específicos de especie y poder diseñar un par de ellos para poder discernir entre B. haptospurs y B. ranarum, C. bertholletiae y C. elegans o C. polymorpha, M. circinelloides y M. ramosissimus, Rhizopus azygosporus y R. microsporus, y R. miehei y R. pusillus"