Diseño y evaluación experimental de la selectividad de oligonucleótidos cebadores especie-específicos para la levadura patógena candida glabrata

Abstract

"Muchas especies de levadura ascomicetos del género Candida están ampliamente distribuidas en la naturaleza y actúan como constituyentes saprófitos comunes de la microflora humana normal. Sin embargo, algunas de estas especies de hongos también pueden convertirse en patógenos oportunistas tras una transición de una fase comensal a una patógena, inducida por alteraciones en el entorno huésped (Papon et al., 2013). Las infecciones fúngicas invasivas tales como candidiasis, representan un problema de salud pública de gran importancia. En los últimos 10 años, el número de infecciones causadas por especies de Candida ha aumentado progresivamente. Aunque la mayoría de los casos de candidiasis se han atribuido a Candida albicans, recientemente se han identificado otras especies (C. parapsilosis, C. tropicalis y C. glabrata) como patógenos comunes (Silva et al., 2009). Una de las principales contribuciones a la virulencia de Candida es su versatilidad para adaptarse a una variedad de hábitats y la formación de comunidades microbianas adheridas a las superficies conocidas como biopeliculas. La capacidad de formación de biopelículas puede conferir una ventaja ecológica, ayudando a la supervivencia como comensales y patógenos de los humanos al permitirles evadir los mecanismos inmunes del huésped, resistir el tratamiento antifúngicos y resistir la presión competitiva de otros microorganismos (Silva et al., 2009). Además, cuentan con adhesinas, bombas de extrusión multi-drogas y flujo de salida de antibióticos que confieren resistencia a diferentes antifúngicos. Estas especies de levadura muestran resistencia diferencial a múltiples fármacos como azoles, incluidas las equinocandinas y la anfotericina, y debido a una mala identificación de las especies se puede administrar una terapia antifungica inadecuada, por lo cual destaca la importancia de la identificación correcta de las especies (Schelenz et al., 2016). La identificación rápida y confiable de la especie de Candida que está ocasionando la invasión en el hospedero, mejora los resultados del paciente y acorta el tiempo de hospitalización (Schelenz et al., 2016). Existen diferentes métodos de detección como hemocultivo que es considerado como convencional, es inespecífico y el tiempo de identificación tiende a ser de 3 a 4 días. Se han desarrollado otras técnicas como ELISA, MALDI-TOF, (Zheng et al., 2014). Estos métodos de detección aportan alta sensibilidad y especificidad en periodos cortos de procesamiento, eliminan las limitaciones de los métodos convencionales para la detección e identificación de patógenos, ahorran mano de obra y reducen errores humanos, al contar con un proceso automatizado; sin embargo, cada uno de estos métodos presenta sus limitaciones como el alto costo y el difícil acceso de todos los laboratorios de análisis como en el caso del método que utiliza el espectrómetro de masas (MALDI-TOF) (Huertas et al., 2019). Para la identificación rápida y confiable se necesita de un método altamente específico, sensible, rápido y que su costo no sea tan elevado. Los métodos basados en ADN han mostrado tener esas características, sin embargo estas técnicas requieren del empleo de oligonucleótidos diseñados de tal manera que puedan ser dirigidos a blancos específicos presentes en el genoma del patógeno. En este trabajo se presenta una herramienta que permite identificar regiones únicas de un genoma determinado, por ejemplo el genoma de una especie patógena como Candida glabrata. Esta herramienta se llama BESTur (Herramienta de búsqueda potenciada por BLAST). Empleamos esta herramienta bioinformática para ayudar en el diseño de los oligonucleótidos cebadores específicos para la especie de levadura patógena C. glabrata y poder implementar una técnica basada en ADN como lo es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El diseño de los oligonucleótidos dirigidos a esas regiones únicas identificadas en el genoma de la levadura empleando la herramienta BESTur, le dieron mucha especificidad a la técnica de PCR. En este trabajo se muestran los resultados de las pruebas bioinformáticas y de especificidad experimental, así como la identificación de regiones únicas del genoma de esta levadura patógena y el diseño de oligonucleótidos cebadores especie-específicos"