Detección in vitro de oosporas de phytophthora infestans (mont.) de bary.

Abstract

"El presente trabajo de investigación se realizó en el Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (C1NVESTAV-IPN) Unidad Irapuato, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional Y la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro en Saltillo, Coahuila; en el periodo de Febrero del año 2000 a Julio del año 2001. El trabajo tuvo como objetivo el desarrollar una metodología de detección in vitro de oosporas de P. infestans. En esta investigación se utilizaron aislados de los dos grupos de compatibilidad sexual de Phytophthora infestans (grupos Al y A2) los cuales fueron confrontados en medio de cultivo centeno agar, de esta manera se obtuvo concentraciones de oospora de 80,000 hasta 160,000 oosporas/ml, posteriormente estas oosporas fueron perfectamente purificadas con el complejo enzimático Novozym " 234; ya purificadas, se obtuvo la proteína de oosporas y micelios de diferentes especies de Phytophthora incluyendo a infestans y fueron cuantificadas las proteínas mediante el método de Bradford, 1976 y Kruger, 1994. Se realizó electroforesis en SDS- Poliacrilamida y se obtuvieron cuatro bandas proteicas exclusivas en el patrón de oosporas, tal es el caso de las bandas con un peso molecular de aproximadamente 17 kDa y 106 kDa en las oosporas y dos bandas de bajo peso molecular de aproximadamente 8.2 y 8.7 kDa. También se observó en el patrón electroforético que existen bandas proteicas conservadas en el micelio de todas las especies de Phytophthora incluyendo infestans; así como a las oosporas de P. infestans la banda presentó un peso de 19.9 kDa. Otra observación derivada del perfil electroforético es la presencia de una banda de 14 kDa en el patrón de P. cinnamomi, que es muy semejante a la que se observa en P. citrophthora, esta misma banda se presentó también en P. citricola. Para la inmunodetección se eligieron dos anticuerpos desarrollados previamente los cuales fueron específicos a oosporas de P. infestans; ya que se requería que la inmunodetección fuera lo más específica y evidente posible. La autorradiografía de los anticuerpos reveló una fuerte inmunodetección de dos bandas proteicas de bajo peso molecular de aproximadamente 33.2 y 26.9 kDa, respectivamente; dichas bandas no sólo fueron detectadas en oosporas, sino también en micelio de P. cinnamomi, P. parasitica, P. citrophthora y P. capsici, pero no se presentaron en P. infestans. También se pudo observar que en la muestra de oosporas se detectaron por este mismo suero, otras dos bandas proteicas de un alto peso molecular correspondientes a 106 y 123.6 kDa aproximadamente, mismas que no se presentan en el resto de las muestras; es decir, fueron específicas para oosporas."