Identificación y clonación de una Snakina de Phaseolus vulgaris expresada diferencialmente en el proceso de nodulación

Abstract

"Los péptidos antimicrobianos son un grupo de péptidos pequeños ricos en cisteínas y dentro de ellos se encuentran las GASA/Snakinas, las cuales son parte de la inmunidad en plantas, presentan un tamaño promedio de 64 a 1099 residuos de aminoácidos y hasta el momento todos los estudiados presentan una actividad antimicrobiana como su función principal. Por otra parte, existe un grupo de péptidos antimicrobianos ricos en cisteína denominados como péptidos ricos en cisteína "NCR", los cuales se consideran importantes efectores biológicos necesarios para la diferenciación terminal en la simbiosis de Medicago truncatula y Sinorhizobium meliloti en el desarrollo de nódulos indeterminados. Para las plantas que forman nódulos determinados como los de la simbiosis entre Phaseolus vulgaris y Rhizobium no se han reportado este tipo de "NCR". Sin embargo, con el creciente número de transcriptomas reportados de la simbiosis de P. vulgaris y rhizobium se han encontrado secuencias putativas de péptidos antimicrobianos y de las GASA/Snakinas que muestran cambios significativos en los niveles de expresión génica. Sin embargo, se desconoce si estos péptidos, en particular las GASA/Snakinas, desempeñan alguna función en el proceso de nodulación. En el presente trabajo, se realizó la identificación de las secuencias putativas de las GASA/Snakinas en el genoma de P. vulgaris. Una exploración en los transcriptomas de P. vulgaris, señala que dentro de las secuencias de las GASA/Snakinas la secuencia denominada Snakina 25 muestra un cambio significativo en los niveles de transcritos durante el proceso de nodulación. La secuencia codificante Snakina 25 se amplificó a partir cDNA y se clonó en un vector pENTR/D. La clonación del fragmento con la secuencia Snakina 25 fue confirmada por secuenciación en la unidad de síntesis y secuenciación del IBt-UNAM. El análisis de secuencia a partir de un alineamiento múltiple, demostró que la secuencia de interés posee el dominio GASA/snakina y la firma conservada de residuos de aminoácidos de cisteínas. Un modelado estructural de la secuencia de residuos de aminoácidos Snakina 25, usando como molde la estructura PDB: 5E5Q, sugiere que el plegamiento es el característico de las snakinas. La secuencia Snakina 25 se encuentra lista para realizar la recombinación del vector PENTR/D con el vector binario de plantas el cual presenta un promotor constitutivo 35S del CaMV y el terminador NOS, que constituyen el "cassette" de expresión. El resultado de este trabajo permitirá a futuro explorar el papel de las snakinas en el proceso de nodulación entre P. vulgaris y Rhizobium y será clave en estudios posteriores"