Determinación de metabolitos secundarios y código de barras de adn de vitroplantas de turbinicarpus valdezianus

Abstract

"En el presente trabajo se propagó material vegetal de T. valdezianus por medio de la técnica de cultivo de tejidos con los siguientes objetivos i) Establecer la fase móvil (mezclas de solventes) más adecuada para la separación de los componentes presentes en los extractos de vitroplantas en diferentes etapas de desarrollo y de plantas cultivadas en invernadero de T. valdezianus; ii) Generar una metodología de separación y obtención de metabolitos a partir de vitroplantas de T. valdezianus en diferentes etapas de desarrollo; iii) Identificar y caracterizar parcialmente los alcaloides a partir de vitroplantas y especies cultivadas en invernadero de T. valdezianus en diferentes etapas de desarrollo; iv) Determinar el rendimiento de alcaloides, metabolitos secundarios presentes en T. valdezianus a base de metanol mediante cromatografía de capa fina; v) Describir el código de barras de ADN de T. valdezianus basado en las secuencias de dos genes (matK y rbcL). El material vegetal partió de 6 frascos de vitroplantas, incrementado por medio de micropropagación. Del cual se clasificaron de acuerdo a su etapa de crecimiento (tamaño de brote), comparadas con plantas procedentes de vivero (donadas por el Museo del Desierto de Saltillo), formando ocho grupos (AS, AF, BS, BF, CS, CF, DS Y DF). Las muestras se manejaron en su condición física fresca y seca. El método de extracción de metabolitos secundarios en las muestras se llevó a cabo por medio de una extracción con metanol, ayudado por una plancha de agitación eléctrica a 100 rpm durante 72 horas. Realizando a estos pruebas colorimétricas con una concentración estandarizada de 10,000 ppm. Se probaron diez sistemas (mezclas) de solventes para seleccionar la fase móvil más adecuada en la cromatografía de

v

capa fina (CCF o cromatografía de capa delgada CCD), utilizando cuatro reveladores distintos (cámara de onda larga, onda corta, cámara de yodo y reactivo de Dragendorff). Se corrieron placas cromatografícas de 20 x 20 cm con los extractos completos, y se aislaron las bandas positivas para alcaloides de cada grupo para determinar el porciento de rendimiento de estos. También se extrajo material genético de vitroplantas para amplificar y secuenciar con ayuda de dos genes iniciadores matK y rbcL, para la descripción del código de barras de ADN. Los resultados referentes a la parte de metabolitos secundarios, indican que todos los grupos tanto de muestras frescas como secas, mostraron una reacción positiva a la presencia de alcaloides para las pruebas de Dragendorff, Wagner y Mayer. Las muestras secas, tuvieron una reacción visiblemente más intensa por lo que se continuó el resto de las pruebas solo con los grupos en condición física de muestras secas. En cuanto al sistema de solventes el más adecuado fue el sistema número ocho el cual estuvo compuesto por Hexano – Acetona en concentraciones 80:20 debido ya a que este sistema fue el que mostró mayor número de bandas. Los cuatro grupos de muestras secas fueron positivos para alcaloides, en por lo menos, una de sus bandas de la placa cromatografica, y se aislaron estas bandas, calculando el porciento de rendimiento de alcaloides. Los siguientes resultados mostraron, para el grupo AS 2.6%, BS 1.8%, CS 3.4% y DS 28.6%. Por lo que el grupo con mayor porcentaje de rendimiento, fue el D seco, mientras que para las vitroplantas, fue el grupo C seco. En lo referente al código de barras de ADN, el análisis de las secuencia en BLAST, mostraron tanto en matK como rbcL valor alto de identidad así como de calificación vi (Score). Por lo que se concluye que el código de barras es una herramienta útil, en la identificación de organismos. Encontrando valores de identidad máxima de hasta el 100%. Las secuencias rbcL fueron menos constantes en comparación con las frecuencias analizadas con matK, de acuerdo a su valor máximo de calificación e identidad. Tomando en cuenta el puntaje máximo de calificación en la tablas, las especies que muestran más alta similitud es en general Turbinicarpus schmiedickeanus para la muestras analizadas con el gen matK, mientras que al ser analizadas esta mismas con el gen rbcL los géneros con la similitud mayor son Lepismium, Schlumbergera y Hatiora. Por lo que de acuerdo a estos resultados se infiere que el código de barras de ADN es útil para la identificación de organismos, y en el caso particular de este trabajo con los genes empleados (matK y rbcL) ayudo en la identificación de genero Turbinicarpus."